如何用第三代试管婴儿技术阻断多囊肾病的遗传？

常染色体显性多囊肾病

常染色体显性多囊肾病 (autosomal dominant polycystic kidney disease，ADPKD) 是最常见的遗传性肾病，在全球范围都有发生，发病率大约为1/400-1/1000。

现在认为，常染色体显性多囊肾与两个基因缺陷有关。85％的患者是由位于16号染色体的PKD1基因（TRPP1）发生变异所致，15％的患者是由4号染色体的PKD2基因（TRPP2）变异所致。近来报道 GANAB基因 和 DNAJB11 基因变异也可引起ADPKD。该病可遗传至子代，子代发病概率为50%。

ADPKD主要影响肾脏，患者多在成年后双侧肾脏出现囊肿，随年龄增长，逐渐长大的囊肿压迫正常肾组织，损害肾脏结构和功能。但也可能会影响其他器官，如肝脏、胰腺、脑动脉血管等。患有这种疾病的人大约有一半将会发展为终末期肾脏疾病 (end stage renal disease，ESRD)，需要进行透析或肾移植。患者进展为终末期肾病通常发生在40-60岁之间。

ADPKD是无法治愈的，但对症治疗可以缓解症状，延长患者的生命。临床上，缺乏有效治疗 ADPKD 的药物和措施，多以对症支持治疗为主。新近一些国家批准托伐普坦 (tolvaptan) 治疗ADPKD，但从有效性和安全性考虑，该药仅适用于部分快速进展型 ADPKD 患者。

尽管对常染色体显性多囊肾研究进展很快，但本病的预后变化从发现至今不大。有人认为避免摄入咖啡因可以防止形成囊肿。治疗高血压和低蛋白饮食可减缓疾病的进展，但没有得到很好的验证。PKD1基因突变导致的常染色体显性多囊肾预后比PKD2基因突变的更差。

如何诊断ADPKD

ADPKD 诊断标准如下：① ADPKD 家族遗传病史，大约 80% 患者有家族遗传病史；②影像学检查显示双肾体积增大，有多个大小不一囊肿。若无家族遗传史或影像学检查不典型，需进行 PKD1和PKD2 基因变异检测，变异检出率约 90%。在没有常染色体显性多囊肾家族史的人，出现双肾肿大和囊肿，伴有或没有伴有肝囊肿，并且不存在其他表现的，提示可能肾囊肿性疾病，但并非诊断明确的证据。

胚胎植入前遗传学检测

preimplantation

genetic test，PGT

该病可遗传至子代，子代发病概率为50%。传统的产前诊断仅能在孕中晚期通过彩色超声诊断技术、绒毛或羊水细胞进行基因检测，无论终止妊娠与否，均给孕妇及家庭带来极大的身心痛苦。

患者只能依靠透析或肾移植维持生命，给家庭和社会带来沉重负担。应用胚胎植入前遗传学检测技术 (preimplantation genetic test，PGT) 阻断 ADPKD 致病性的基因变异的遗传，可极大地降低患儿出生率，提高我国出生人口素质。

胚胎植入前遗传学检测 (preimplantation genetic test，PGT) 是将遗传学检测与辅助生殖相结合的一项技术，通过体外受精、培养，对体外形成的胚胎进行基因检测和信息学分析，挑选不携带致病性的基因变异、基因组拷贝数正常的胚胎移植入母体内，获得健康的婴儿，阻断致病性的基因变异遗传给子代 。

PGT流程

1.控制性超促排卵：根据女方卵巢功能评估选用适当的超促排卵方案。需根据患者多囊肾病病情适当调整用药，特别是女方为多囊肾病患者，如存在肾功能损害，应酌情降低促排卵药物用量，避免加重肾脏负担。

控制性卵巢刺激（controlled ovarian stimulation， COS）指通过外源性促性腺激素（FSH）刺激卵巢、促进卵泡发育。待卵泡成熟时，注射药物（HCG）触发卵泡内的卵母细胞成熟，36小时后即可在超声引导下穿刺卵巢取得卵母细胞。

控制性超促排的原理，就是外源性注射促性腺激素FSH，提高血中的FSH浓度，让卵泡颗粒细胞上FSH受体少的非优势卵泡也能发育，促使继续发育成熟，帮助获得较多卵母细胞以供体外受精，提高试管婴儿的累计妊娠率。

2.取卵：卵泡成熟后按照辅助生殖技术程序经阴道超声引导下穿刺取卵。

3.授精：采用卵胞质内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI) 授精方式，以最大限度地减少母源颗粒细胞和父源精子对下游遗传学检测准确性的干扰。

4.胚胎活检：囊胚活检对胚胎发育的潜在影响较小，已成为目前主要活检方式。囊胚期活检是在授精后第 5~6 日、囊胚充分扩张后进行。建议活检囊胚评分 4BC，通常活检后的囊胚需立即冷冻保存，待胚胎遗传学分析完成后，择期对染色体拷贝数正常、不携带亲代基因变异的胚胎进行复苏移植。

囊胚：当胚胎发展到卵裂阶段的第三天。含有6至8个细胞的胚胎可以用来做活体组织检查。每个细胞被称为卵裂球。培育成囊胚之后，胚胎含有超过100个细胞。这些细胞被分裂成滋养外胚层细胞，它们最终会变成胎盘和内细胞团，而内细胞团则发育成婴儿。移出3-5个滋养外胚层细胞对内细胞团影响非常小。由于第3天的胚胎仅含有6--8个细胞，移出1或2个细胞对胚胎的发育和移植有更大的负面影响。因此进行卵裂球活检后的胚胎着床率比滋养外胚层活检后的低20％。

囊胚活检过程：囊胚由两种不同的细胞类型组成，即内细胞团（ICM）和滋养外胚层。ICM细胞会发育成胎儿，而滋养外胚层细胞则将继续发育成胎盘胚胎侧的胚胎细胞。试管婴儿滋养外胚层活检，就是从囊胚的滋养层中取出一小组细胞进行活体检查（通常5到10个）。

取出的细胞可以用于全面染色体筛选（CCS）或进行特定的遗传性疾病测试。体外培养的胚胎通常会在第5、6天发育至囊胚，此时胚胎的细胞数目明显增多，可以达到100个以上。囊胚的滋养层细胞将来会发育成胎盘或胎膜，不参与形成胎儿部分。

因此，活检囊胚的滋养层细胞，不仅能够最大程度地反映胚胎的遗传信息，而且也能够避免对胎儿部分的损伤。囊胚的滋养层活检可以获得的细胞数目增多，而且囊胚期胚胎染色体嵌合比例显著低于卵裂期胚胎，这些都提高了遗传诊断的准确性；同时囊胚的培养技术、玻璃化冻融技术越来越成熟以及激光仪器的发展也为囊胚活检的广泛应用提供了技术保障。

5.透明带打孔：透明带打孔方法有机械法和激光法。目前激光法更为常用。在活检时应尽量避免对细胞造成热损伤。囊胚活检透明带打孔可以在授精后第3日、第5日、活检前4 小时或活检时进行。

哺乳类动物的卵子及胚胎外面有透明带结构，透明带的主要成分为糖蛋白。卵子成功受精后，可见透明带硬化，胚胎需要从透明带中逸出．在分裂期胚胎时生成的分解素与物理性扩张可造成透明带变薄。囊胚期内细胞团从透明带中孵出，这是胚胎完成着床的先决条件。胚胎在体外培养过程中，培养基本身会导致透明带变硬．同时胚胎在冻融过程中透明带硬化现象会进一步加剧，影响了冷冻胚胎移植的妊娠结局。还有， 包括冷冻损伤、不理想的外培养条件、透明带较厚、胚胎质量不好、女性年龄等诸多问题都可能影响透明带的质地，造成硬化，降低透明带弹性，从而阻碍了体外发育的胚胎移植后正常从经由透明带孵出，造成胚胎孵出失败。因此通过透明带打孔促进胚胎经由透明带孔孵出而获得更高的妊娠率。

6.活检细胞的数目：囊胚活检采集的滋养细胞数目应控制在 5~10 个。

7.重复活检二次活检：反复活检将影响胚胎的发育潜力，但在首次活检诊断不明时，可以考虑二次活检；如果胚胎活检后已冷冻，可考虑复苏后再次活检。

8.囊胚活检部位：囊胚活检应选择远离内细胞团的部位。

9.活检胚胎的冷冻：在等待遗传学检测结果时，需要对活检后的胚胎进行冷冻保存。建议采用玻璃化冷冻技术，活检后的卵裂期或囊胚期胚胎的冷冻方法与常规胚胎冷冻方法相同。

10.活检样本的预处理：利用核酸扩增法进行遗传学检测，活检所移取的细胞经过洗涤后应放入含有 2.5 µL 磷酸盐缓冲液 ( 或遗传检测试剂盒所要求的预装试剂 ) 的 PCR 管中，同时移取少许洗涤液到空白 PCR 管中作为空白对照。

11.胚胎活检生物样本的储存和运输。

12.胚胎活检生物样本遗传学基因检测。

13.胚胎移植前咨询：医疗机构向患者夫妇解释各个胚胎的检测结果，根据检测结果告知胚胎的处置方式并根据具体情况为患者提供建议。对于结果为可移植的胚胎，应告知其不排除误诊的可能。不携带致病基因突变但为染色体嵌合的胚胎，经充分知情同意后，可作为备选移植胚胎。

14.胚胎移植：建议行单胚胎移植。根据女方月经周期、宫内环境、激素水平等情况，择期行可移植胚胎复苏移植。黄体支持等后续处理同其他体外受精-胚胎移植患者。对于女方为多囊肾病患者，黄体支持应选择对肝肾功能无影响或影响尽量小的药物及给药途径。

15.产前筛查：胚胎移植后获得持续妊娠者，在妊娠 18~20 周抽取 20~30 mL 羊水进一步做产前诊断。产前诊断结果与胚胎检测结果符合率应为100%。现阶段不建议采用无创产前筛查的方法。

16.随访：内容包括妊娠情况，产前诊断结果，妊娠结局以及胎儿、新生儿情况等。远期随访同其他体外受精胚胎移植患者。

PGT 阻断 ADPKD 遗传的流程图

以上部分源自《应用胚胎植入前遗传学检测技术阻断常染色体显性多囊肾病遗传的中国专家共识》